Thứ bảy, 19/12/2020 10:36 GMT+7
Nghiên cứu thiết kế hệ thống vector biểu hiện gen nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp enzyme ở nấm sợi Aspergillus oryzae
Aspergillus oryzae là loài nấm sợi được sử dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm truyền thống và đồ uống tại nhiều nước châu Á gồm Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan, Việt Nam và Philipin. Tuy nhiên loài nấm này thường dễ bị nhầm lẫn với loài gần gũi là Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin. Để phân biệt chính xác A. oryzae với A. flavus, các phương pháp xác định khả năng sinh độc tố aflatoxin hoặc phát hiện sự có mặt của các gen liên quan đến sinh tổng hợp aflatoxin bằng PCR thường được sử dụng. Vi nấm A. oryzae có khả năng tiết lượng lớn các enzyme vào môi trường nuôi cấy, do đó loài nấm này đã và đang được sử dụng rộng rãi trong sản xuất nhiều loại enzyme thương mại. Gần đây loài nấm này cũng đã được ứng dụng trong sản xuất các enzyme và protein tái tổ hợp. Tuy nhiên việc nghiên cứu biểu hiện gen ở nấm sợi A. oryzae mới chỉ sử dụng phương pháp chuyển gen thông qua tế bào trần (protoplast transformation). Phương pháp này bao gồm nhiều bước thực hiện phức tạp với chi phí cao và kết quả thí nghiệm thiếu ổn định ở những lần lặp lại. Việc phát triển các phương pháp chuyển gen hiệu suất cao với chi phí thấp cho vi nấm A. oryzae sẽ là một lợi thế để có thể ứng dụng loài nấm sợi này vào sản xuất enzyme tái tổ hợp định hướng thương mại. Mặc dù từ năm 1998 phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã được thực hiện thành công trên nhiều loài nấm sợi khác nhau, nhưng phương pháp này chưa được thực hiện trên nấm sợi A. oryzae.
Phương pháp chuyển gen nhờ A. tumefaciens đơn giản, dễ thực hiện và có chi phí thấp do bào tử nấm được sử dụng trực tiếp làm nguyên liệu chuyển gen. Thêm vào đó, do A. oryzae kháng lại hầu hết các loại kháng sinh dùng trong chuyển gen ở vi nấm nên các vector biểu gen ở loài nấm sợi này phải sử dụng marker trợ dưỡng. Đề tài: “Nghiên cứu thiết kế hệ thống vector biểu hiện gen nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp enzyme ở nấm sợi Aspergillus oryzae” đã được nhóm nghiên cứu tại Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội do TS. Trần Văn Tuấn dẫn đầu, thực hiện trong giai đoạn từ năm 2014-2016. Đây là lần đầu tiên các nhà khoa học phát triển thành công phương pháp chuyển gen vào A. oryzae nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sử dụng hệ vector nhị thể (binary vector) mới với các promoter điều hòa biểu hiện gen rất mạnh là gpdA hoặc amyB. Các vector này đều mang marker trợ dưỡng dùng cho chọn lọc thể chuyển gen là pyrG thay vì sử dụng gen kháng kháng sinh, do đó, sẽ không tạo ra các chủng vi nấm kháng thuốc trong quá trình nghiên cứu.
Mục tiêu chính của đề tài là tạo được một hệ thống vector nhị thể với các promoter mạnh dùng cho biểu hiện gen ở vi nấm A. oryzae với phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens. Hệ thống vector tạo được sẽ phục vụ thiết thực cho các nghiên cứu nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp enzyme ở nấm sợi A. oryzae; và đưa ra được phương pháp xác nhận và phân biệt nhanh các chủng A. oryzae an toàn với A. flavus sinh độc tố aflatoxin.
Một số kết quả của nghiên cứu:
- Đã tạo được các chủng A. oryzae trợ dưỡng uridine/uracil bằng cách xóa gen pyrG (gen mã hóa enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp uridine/uracil) trên hai chủng A.oryzae VS1 và A. oryzae RIB40 sử dụng cùng vector xóa gen là pAoG. Cấu trúc xóa gen pyrG được chuyển vào A. oryzae sử dụng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, hiệu suất xóa gen đạt 100%. Tất cả các chủng trợ dưỡng uridine/uracil đều bị xóa gen pyrG.
- Đã tạo được 7 vector nhị thể chứa marker chọn lọc là gen pyrG dùng cho chuyển gen vào các chủng A. oryzae trợ dưỡng uridine/uracil gồm: 1 vector xóa gen pyrG, 1 vector biểu hiện gen huỳnh quang GFP, 2 vector biểu hiện gen huỳnh quang DsRed, 02 vector dùng cho biểu hiện tái tổ hợp gen mã hóa enzyme phytase. Các vector này đều hoạt động tốt khi được chuyển vào chủng trợ dưỡng VS1, RIB40 và AUT1-PlD.
- Ứng dụng thành công hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens mới xây dựng để biểu hiện gen phyA mã hóa enzyme phytase từ nấm sợi Aspergillus fumigatus trong hai chủng trợ dưỡng VS1 và AUT1-PlD. Enzyme phytase tái tổ hợp có hoạt tính tốt, có khả năng bền nhiệt đến 90ºC. Bên cạnh đó, chúng tôi đã tìm được môi trường cám gạo để để nuôi các chủng nấm cho tách chiết lượng lớn enzyme phytase tái tổ hợp nhằm giảm chi phí sản xuất.
Có thể tìm đọc toàn văn báo cáo kết quả nghiên cứu (Mã số 14897/2017) tại Cục Thông tin khoa học và công nghệ quốc gia.